Thermo Fisher Scientific Primagam Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit Instruções de operação

Marca: Thermo Fisher Scientific

Modelo: Primagam Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit

Tipo: Instruções de operação

Primagam™ Non‑Human Primate M. tuberculosis

Interferon‑Gamma Kit

ELISA para detecção de tuberculose em primatas não humanos

Referência de catálogo 63311

N.º de pub. MAN0018721 Rev. A.0

Tecnologia Espécie Tipo de amostra

ELISA Primatas não humanos Sangue total

ATENÇÃO! Leia as Fichas de Informações de Segurança de Produtos Químicos (FISPQ) e siga as instruções de manuseio. Use

roupas, óculos e luvas de proteção adequados. Ficha de Informações de Segurança de Produto Químico (FISPQ) estão disponíveis

em thermosher.com/support.

Descrição do produto

O Applied Biosystems™ Primagam™ Non-Human Primate M. tuberculosis Interferon-Gamma Kit é um teste de diagnóstico baseado em

ELISA que mede o interferon-γ (IFN-γ) nas amostras de sangue total para detectar tuberculose (TB). A liberação de IFN-γ em resposta ao

estímulo com os antígenos derivados da proteína puricada (PPD) de tuberculina é um biomarcador altamente preditivo da infecção de

TB. O kit detecta o IFN-γ nas seguintes espécies: Aotus (macaco-da-noite), Ateles (macaco-aranha), Colobus (Colobus guereza),

gibão/siamang, Cercopithecus/macaco-do-pântano, Semnopithecus, lêmur, Macaca ssp, mandril, zaris, macaco-esquilo, sagui e macaco-

vervet.

A tuberculose é uma doença progressiva que afeta o sistema respiratório dos primatas. Pode ser transmitida de um primata não humano

para seus cuidadores em zoológicos e laboratórios de pesquisa, o que representa um risco para a saúde pública. O teste de tuberculinização

intradérmico é o método tradicional que é usado para testar TB em primatas não humanos. Este teste requer imobilização e detecta TB com

base na inamação e inchaço no local da injeção. O teste Primagam™ Non-Human Primate M. tuberculosis Interferon-Gamma Kit pode ser

usado para a detecção de TB associado com ou como uma alternativa ao teste de tuberculinização intradérmico.

O kit segue um procedimento laboratorial de dois dias:

•Dia 1 — As amostras de sangue total são coletadas em tubos de heparina e depois as alíquotas de cada amostra são incubadas com

um antígeno único: Bovine PPD, Avian PPD ou Nil Antigen Control.

•Dia 2 — O IFN-γ, que é produzido pelos linfócitos estimulados pelo antígeno, é medido com o uso da técnica de ELISA.

O kit foi avaliado durante um surto de tuberculose em 54 macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) e 22 rhesus (Macaca mulaa). Os

resultados do kit revelaram sensibilidade de 92% com especicidade de 100%. Uma avaliação extra em uma colônia separada,

presumivelmente sem TB com base no histórico, e um regime de testes cutâneos regulares, também resultaram em 100% de especicidade.

INSTRUÇÕES DE USO

Somente para uso veterinário. Somente para uso in vitro.

Conteúdo e armazenamento

São fornecidos reagentes e placas para 30 testes.

Nota: Para obter as instruções de reconstituição e de diluição, consulte “Antes de começar“ na página 3.

Tabela 1 Primagam™ Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit (Ref. de cat. 63311)

Conteúdo Descrição Quantidade Armazenam

ento [1]

Microplate Strip[2] Pronto para uso. 2 microplacas com 96 poços

cada

2 °C a 8 °C

Bovine PPD Dilua antes do uso. 5 ml

Avian PPD Dilua antes do uso. 5 ml

Nil Antigen Control

• Pronto para uso.

• Contém 0,01% de timerosal peso

por volume (w/v).

5 ml

Positive Primate IFN-γ Control • Reconstitua antes do uso.

• Contém timerosal 0,01% (w/v).

1 frasco de sólidos

lioﬁlizados

Negative Primate IFN-γ Control • Reconstitua antes do uso.

• Contém timerosal 0,01% (w/v).

1 frasco de sólidos

lioﬁlizados

Green Diluent (Amostra e tampão do diluente conjugado) • Pronto para uso.

• Contém timerosal 0,01% (w/v). 40 ml

Conjugate‑100x Concentrate (Anticorpo IFN‑γ antiprimata

marcado com peridoxidase de rábano)

• Reconstitua antes do uso.

• Contém timerosal 0,01% (w/v).

1 frasco de sólidos

lioﬁlizados

Wash Buffer‑20x Concentrate • Dilua antes do uso.

• Contém timerosal 0,01% (w/v). 2 × 50 ml

Enzyme Substrate Buffer • Pronto para uso.

• Contém H2O2.30 ml

Chromogen Solution‑100x Concentrate • Dilua antes do uso.

• Contém TMB em DMSO. 0,5 ml

Enzyme Stopping Solution • Pronto para uso.

• Contém H2 SO2 0,5 M. 15 ml

[1] Consulte a data de validade no rótulo.

[2] Os poços são revestidos com anticorpos contra IFN‑γ de primata.

Materiais necessários não fornecidos

A menos que haja orientações diferentes, todos os materiais estão disponíveis em thermosher.com.

Item Fonte[1]

Instrumentos

Multiskan™ FC Microplate Photometer, ou leitor de microplacas equivalente[2] 51119000

Wellwash™ Microplate Washer, ou equivalente 5165000

(Opcional)

Agitador de microplacas MLS

(Opcional)

Homogeneizador para tubos MLS

Instruções de uso Primagam

™

Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit

Item Fonte[1]

Equipamentos

Cabine de biossegurança (BSC, nível II) MLS

Pipeta monocanal (10 a 1000 µl) MLS

Pipeta multicanal (50 a 500 µl) MLS

Misturador para laboratório (vórtex ou equivalente) MLS

Porta-agulhas, 2 a 3 por coletor MLS

Incubadora úmida ajustada para 37 °C MLS

Provetas (100 ml, 1 L e 2 L) MLS

Tubos, placas e outros suprimentos

Tubos com heparina de lítio para coleta de sangue, 1 tubo por animal MLS

Agulhas de 23G a 18G para Vacutainer de 1,5 pol., 1 agulha por animal MLS

Pipetas estéreis graduadas de 1 ml ou 5 ml MLS

Placa de cultura com 24 poços, 1 placa a cada 8 animais MLS

Microtubos de 1 ml no formato de 96 poços com estante e tampas, 1 estante a cada 30 animais MLS

Tubos de polipropileno MLS

Ponteiras de pipeta (conforme recomendado pelo fabricante da pipeta) thermoﬁsher.com/pipettetips

Reservatórios de solução MLS

Reagentes

Água deionizada ou destilada (2 L) MLS

Meio RPMI ou PBS (1X), pH 7.4 MLS

[1] MLS: Fisher Scientific (fisherscientific.com) ou outro importante fornecedor de produtos para laboratório.

[2] O leitor de microplacas deve ter a capacidade de medição em 450 nm com um filtro de referência entre 620-650 nm.

Diretrizes do procedimento

• Seguir rigorosamente as Regulações Nacionais de Segurança.

• Utilize o protocolo do kit em laboratórios adequados para o seu propósito.

• Considere as amostras como possivelmente infecciosas e todos os itens que entrarem em contato com as amostras como possivelmente

contaminados.

• Manuseie todas as amostras de sangue de primatas em uma cabine de biossegurança (BSC, nível II).

• Realize o ensaio de todas as amostras e dos controles em duplicata.

• Descarte os recipientes e reagentes não utilizados de acordo com as exigências locais de resíduos biomédicos.

• Troque as ponteiras da pipeta após cada etapa de pipetagem.

• Mantenha reservatórios separados de solução para cada reagente.

• Não use os componentes do kit após a data de validade ou caso sejam observadas alterações na aparência.

• Não use os componentes do kit que tenham diferentes números de lote de kit.

• Use água destilada ou deionizada ou água de qualidade equivalente.

• Use uma lavadora de microplacas para todas as etapas de lavagem.

Antes de começar

Determine a conﬁguração máxima do agitador de placas

Se for usado um agitador de placas, determine a conguração máxima.

1. Verique se a placa se ajusta com segurança ao agitador.

2. Acrescente 1,6 ml de água em cada poço da placa, depois cubra com um lme de vedação.

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™

Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit

3. Determine a conguração máxima que seja possível usar no seu agitador sem que a água respingue no lme de vedação.

Dilua os antígenos

1. Acrescente 160 µl de Bovine PPD a 840 µl de meio RPMI ou PBS para obter a concentração nal de ensaio de 300 UI/ml.

2. Acrescente 160 µl de Avian PPD a 840 µl de meio RPMI ou PBS para obter a concentração nal de ensaio de 250 UI/ml.

Armazene os antígenos diluídos entre 2 °C e 8 °C por até um mês.

Reconstitua os controles

1. Reconstitua Positive Primate IFN-γ Control e Negative Primate IFN-γ Control em 1,0 ml de água deionizada ou destilada.

2. Deixe repousar por pelo menos 15 minutos, até o conteúdo se dissolver.

3. Inverta suavemente cada tubo de 4 a 5 vezes para misturar.

Armazene os controles reconstituídos entre 2 °C e 8 °C por até três meses.

Reconstitua o Conjugate‑100x Concentrate

IMPORTANTE! Mantenha o Conjugate-100x Concentrate sempre entre 2 °C e 8 °C, mesmo durante a reconstituição.

1. Reconstitua o Conjugate-100x Concentrate em 0,5 ml de água deionizada ou destilada.

2. Deixe repousar por pelo menos 15 minutos, até o conteúdo se dissolver.

3. Suavemente inverta o tubo de 4 a 5 vezes para misturar, depois mantenha entre 2 °C e 8 °C até o uso.

Armazene o Conjugate-100x Concentrate reconstituído entre 2 °C e 8 °C por até 3 meses.

Prepare o Wash Buffer‑1x

Nota: Uma microplaca de 96 poços requer 1 L de Wash Buer‑1x.

1. (Opcional) Se o Wash Buer‑20x Concentrate apresentar um precipitado, aqueça o frasco em banho-maria de 37 °C até que o

precipitado seja dissolvido.

2. Misture o Wash Buer‑20x Concentrate completamente.

3. Combine 1 parte de Wash Buer‑20x Concentrate com 19 partes de água deionizada ou destilada.

Por exemplo, acrescente 50 ml de Wash Buer‑20x Concentrate a 950 ml de água deionizada ou destilada.

4. Misture até obter uma solução homogênea.

Armazene o Wash Buer‑1x em temperatura ambiente (22 ± 3 °C) por até duas semanas ou entre 2 °C e 8 °C por até um mês.

Dia 1 — Colete as amostras de sangue total, depois incube com os antígenos

Colete as amostras de sangue total

1. Colete pelo menos 5 ml de sangue de cada animal nos tubos com heparina, depois transra as amostras para o laboratório à

temperatura ambiente.

2. Faça a cultura das amostras de sangue até 12 horas após a coleta para manter a viabilidade dos linfócitos (próxima seção).

Retire as alíquotas das amostras de sangue e depois incube com os antígenos

1. Misture cada amostra de sangue para garantir que a heparina se dissolva, de acordo com o seu método de mistura.

•Use um agitador de tubo tipo roller — Homogeneíze suavemente por 1 a 2 minutos.

•Por inversão — Inverta suavemente cada tubo 10 vezes.

2. Transra três alíquotas de 1,5 ml de cada amostra de sangue para poços separados de uma placa de cultura de 24 poços (consulte

Tabela 2).

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Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit

3. Acrescente 100 µl de Nil Antigen Control (N), Bovine PPD diluído (B) ou Avian PPD diluído (A) aos poços apropriados que

contenham sangue, de acordo com a tabela a seguir.

Tabela 2 Esquema recomendado de placa de amostra

123456

AAnimal 1

NAnimal 1

BAnimal 1

AAnimal 2

NAnimal 2

BAnimal 2

BAnimal 3

NAnimal 3

BAnimal 3

AAnimal 4

NAnimal 4

BAnimal 4

CAnimal 5

NAnimal 5

BAnimal 5

AAnimal 6

NAnimal 6

BAnimal 6

DAnimal 7

NAnimal 7

BAnimal 7

AAnimal 8

NAnimal 8

BAnimal 8

4. Usando um agitador de placas, misture completamente as amostras com os antígenos por 1 minuto (consulte “Determine a

conguração máxima do agitador de placas“ na página 3).

Alternativamente, se o agitador de placas não estiver disponível, agite a placa de cultura para misturar. Segure a placa e a tampa

juntas com rmeza, agite dez vezes no sentido horário e depois repita no sentido anti-horário.

IMPORTANTE! Para o desempenho ideal do ensaio, assegure-se de que as amostras estejam completamente misturadas com os

antígenos. Não é possível misturar demais.

5. Transra a placa de cultura para uma incubadora úmida ajustada para 37 °C e depois incube durante 16 a 20 horas.

Dia 2 — Colheita de plasma, depois realize o ELISA

Antes de começar

Equilibre todos os componentes do kit (exceto Conjugate-100x Concentrate) à temperatura ambiente, depois misture suavemente os

reagentes, as amostras e os controles.

Nota: Alguns reagentes podem necessitar de algumas horas para equilibrar a temperatura. Se for necessário um tempo menor de

equilíbrio, aqueça os reagentes em banho-maria a 30 °C.

Colete o plasma, depois armazene as amostras (opcional)

1. Remova da incubadora a placa de cultura.

2. (Opcional) Centrifugue a placa em 500 × g à temperatura ambiente por 5 minutos.

3. Evite a parte inferior de hemácias e pipete cuidadosamente para transferir de 150 a 300 µl de plasma para um microtubo de 1 ml

limpo em uma estante de armazenamento de 96 poços (consulte Tabela 3).

Nota: É importante evitar coletar as hemácias com o plasma durante essa etapa. Contudo, uma pequena quantidade de hemácias não

afetará o ensaio.

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Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit

Os seguintes esquemas de armazenamento permitem a transferência eciente de amostras da estante de armazenamento para as tiras

da microplaca, usando uma pipeta multicanal.

Tabela 3 Esquema recomendando de armazenamento de plasma

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 1N[1] 1B 1A 2N 2B 2A 3N 3B 3A 4N 4B 4A

B 5N 5B 5A 6N 6B 6A 7N 7B 7A 8N 8B 8A

C 9N 9B 9A X X X 10N 10B 10A 11N 11B 11A

D 12N 12B 12A 13N 13B 13A 14N 14B 14A 15N 15B 15A

E 16N 16B 16A 17N 17B 17A 18N 18B 18A 19N 19B 19A

F 20N 20B 20A 21N 21B 21A 22N 22B 22A 23N 23B 23A

G 24N 24B 24A X X X 25N 25B 25A 26N 26B 26A

H 27N 27B 27A 28N 28B 28A 29N 29B 29A 30N 30B 30A

[1] Cada poço indica o número do animal seguido pelo antígeno (N—Nil Antigen Control, B—Bovine PPD, A—Avian PPD, X—vazio).

Nota: Após a transferência das amostras para as tiras da microplaca, use os poços vazios (X) para os controles que são fornecidos com

o kit.

4. (Opcional) Armazene as amostras de plasma em microtubos selados em 2 °C a 8 °C por até 28 dias ou em -20 °C por até 5 anos.

Assegure-se de que as estantes de amostras incluam a data, iniciais do operador, o conteúdo dos tubos e as informações do animal.

Realize o ELISA

• Equilibre todos os componentes do kit (exceto Conjugate-100x Concentrate) à temperatura ambiente, depois misture suavemente os

reagentes, as amostras e os controles.

• Determine o número de tiras de microplaca de 8 poços que são necessárias para o ensaio e, em seguida, coloque as tiras nas estruturas

da microplaca. Devolva qualquer tira e estrutura não usada para a bolsa, depois armazene de 2 °C a 8 °C para uso futuro.

= Anticorpo anti-IFN-γ

= IFN-γ

= Conjugado

= Substrato

a. Acrescente 50 µl de Green Diluent em cada poço da microplaca montada.

b. Transra 50 µl de cada amostra de plasma para o poço apropriado contendo Green Diluent.

As amostras de plasma para cada animal devem ser acrescentadas aos poços ao mesmo tempo.

Recomendamos o uso de uma pipeta multicanal.

Nota: As amostras de plasma podem coagular quando descongeladas. Pipete cuidadosamente

para garantir que o volume correto de plasma seja acrescentado em cada poço.

c. Acrescente 50 µl de cada controle ao poço apropriado contendo Green Diluent.

d. Misture as amostras e os controles com Green Diluent usando um agitador de placas congurado

para velocidade de moderada a alta durante 1 minuto.

Alternativamente, se o agitador de placas não estiver disponível, homogeneíze com a pipeta 5

vezes para misturar.

e. Cubra a placa com uma tampa, depois incube por 60 minutos à temperatura ambiente.

1Incube as amostras com

Green Diluent

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a. Lave os poços da microplaca 6 vezes com 400 µl de Wash Buer‑1x, deixando os poços de molho

por 10 segundos em cada lavagem.

Nota: Preencha cuidadosamente os poços com Wash Buer‑1x para evitar contaminação cruzada

com os poços adjacentes.

b. Dê leves batidas com a placa sobre um papel toalha para remover todo o Wash Buer‑1x dos

poços.

2Lavagem dos poços

IMPORTANTE! Prepare o Conjugate-1x por no máximo 15 minutos antes do uso.

a. Para cada tira da microplaca de 8 poços, combine 10 µl de Conjugate-100x Concentrate com 1 ml

de Green Diluent.

b. Misture o Conjugate-1x completamente. Evite a formação de espuma, pois pode provocar

desnaturação do Conjugate.

c. Devolva a porção não usada de Conjugate-100x Concentrate ao armazenamento entre 2 °C e 8 °C.

3Dilua o Conjugate‑100x

Concentrate

a. Acrescente 100 µl de Conjugate-1x em cada poço da microplaca.

b. Misture completamente usando um agitador de placas congurado para velocidade moderada a

alta durante 1 minuto.

Alternativamente, se o agitador de placas não estiver disponível, homogeneíze com a pipeta 5

vezes para misturar.

c. Cubra a placa com uma tampa, depois incube por 60 minutos à temperatura ambiente.

d. Aspire a solução dos poços, depois lave os poços 6 vezes com Wash Buer‑1x (consulte “Lavagem

dos poços“ na página 7).

4Acrescentar o

Conjugate‑1x

IMPORTANTE!

·Prepare a solução do substrato enzimático imediatamente antes do uso.

·Utilize recipientes de plástico polipropileno estéreis. Não use recipientes ou pipetas de poliestireno.

a. Para cada tira da microplaca de 8 poços, combine 10 µl de Chromogen Solution-100x Concentrate

com 1 ml de Enzyme Substrate Buer.

Exemplo: Para seis tiras da microplaca, combine 60 µl de Chromogen Solution-100x Concentrate

com 6 ml de Enzyme Substrate Buer.

b. Misture completamente a solução do substrato enzimático.

Nota: Se surgir uma coloração azul, descarte a solução.

5Prepare a solução do

substrato enzimático

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Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit

Nota: Comece o tempo de incubação de 30 minutos quando a solução do substrato enzimático for

acrescentada ao primeiro poço.

a. Acrescente 100 µl da solução de substrato enzimático em cada poço da microplaca.

b. Misture completamente usando um agitador de placas congurado para velocidade moderada a

alta durante 1 minuto.

Alternativamente, se o agitador de placas não estiver disponível, homogeneíze com a pipeta 5

vezes para misturar.

c. Cubra a placa com uma tampa, depois incube por 30 minutos em temperatura ambiente no

escuro.

6Acrescente e a solução do

substrato enzimático

a. Acrescente 50 µl de Enzyme Stopping Solution a cada poço na mesma ordem em que a solução

de substrato enzimático foi dispensada.

b. Dê leves batidas na lateral da placa para misturar delicadamente.

A solução nos poços muda de azul para amarelo.

c. Leia a placa a 450 nm (ltro de referência entre 620-650 nm) dentro de 5 minutos.

7Acrescentar a Enzyme

Stopping Solution, depois

leia a placa

Analise os resultados

Calcule a absorbância média

1. Calcule o valor médio de OD450 de todas as amostras e os controles.

2. Se IFN-γ for detectado nas amostras estimuladas por Nil Antigen Control, subtraia o valor médio de OD450 dos resultados para

aquele animal.

Nota: A detecção do IFN-γ nas amostras estimuladas por Nil Antigen Control pode indicar coinfecção ou outro distúrbio.

Critérios de validação

Se os seguintes critérios não forem atendidos, os resultados devem ser invalidados e as amostras devem ser testadas novamente.

Tipo de reação OD450 média Coeﬁciente de variação (%)

Negative Primate IFN-γ Control < 0,150 30

Positive Primate IFN-γ Control > 1,00 15

Interpretação dos resultados

Interprete os resultados de acordo com a tabela a seguir:

OD450 média Interpretação

Bovine PPD − Avian PPD > 0,050 e

Bovine PPD − Nil Antigen Control > 0,050 Positivo

Avian PPD > Bovine PPD e

Avian PPD > Nil Antigen Control Negativo[1]

[1] O animal é considerado um reator a PPD aviária.

• Para leituras de absorbância que estão fora do limite do leitor de microplacas, consulte “Teste novamente as amostras com resultados

inválidos“ na página 9.

• Este teste pode fornecer um resultado falso positivo ou falso negativo devido às condições locais. Interprete os resultados no contexto

de todas as informações clínicas, históricas e epidemiológicas disponíveis e relevantes ao animal em teste. Em circunstâncias

especícas, outros testes conrmatórios podem ser necessários.

Instruções de uso Primagam

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Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit

• A interpretação do teste e as consequentes decisões de criação de animais são de responsabilidade do usuário, de um consultor

veterinário, consultor de saúde animal ou autoridade.

Teste novamente as amostras com resultados inválidos

1. Dilua as amostras de plasma 1:4 em Green Diluent.

Por exemplo, acrescente 25 µl do plasma de teste a 75 µl de Green Diluent.

2. Agite no vórtex em velocidade de moderada a alta por 3 a 5 vezes, depois repita o procedimento de ELISA.

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Nota: Para obter a FISPQ de reagentes e produtos químicos de outros fabricantes, entre em contato com o fabricante.

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Life Technologies Corporation e/ou sua(s) aliada(s) garantem seus produtos conforme estabelecido nos Termos e Condições Gerais de

Venda que se encontram em www.thermosher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Em caso de dúvidas, entre em

contato com a Life Technologies em www.thermosher.com/support.

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Traduzido da Publicação em Inglês Número MAN0018635 Rev. A.0.

Histórico de revisão: N.º da pub. MAN0018635

Revisão Data Descrição

A.0 25 de novembro de 2019

• O documento inicial (Primagam_PI_V1.4e_140512.pdf) foi convertido para o modelo de documento atual, com as

atualizações necessárias referentes ao número de publicação, às informações sobre licença limitada, à garantia, às

marcas registradas e aos logotipos.

• Os procedimentos para preparo do antígeno e estimulação de sangue foram atualizados.

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2 Janeiro 2020